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聚丙烯酰胺凝胶(蛋白类)

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:

1 仪器:垂直系列电泳槽;低、中、高压电源;恒温循环器

2 试剂: 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、 考马斯亮蓝\硝酸银、凝胶缓冲液、非变性上样缓 冲液、Tris碱、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝胶电泳

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 仪器:垂直系列电泳槽;低、中压电源、恒温循环器 2 试剂:   丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺, SDS( 十二烷基硫 酸钠)溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8)、0.5MTris- HCl(pH6.8)、TEMED、10%(w/v)过硫酸胺溶液、SDS- Page上样缓冲液:( 0.5M Tris( pH6.8)缓冲液、甘油、 10%SDS 、二硫苏糖醇、溴酚蓝)、Tris、甘氨酸、SDS 、考马斯亮蓝 \硝酸银等

SDS-Page,在蛋白质裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

巯基乙醇或DTT可使蛋白质分子中二硫键还原,使多肽分成单个亚单位。

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SDS-PAGE时,在蛋白质裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

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PAGE据其有无浓缩效应,分为连续系统与不连续系统

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷及分子筛效应; 不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,故分离效果更好。 不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性,使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带,然后进行分离。

样品浓缩效应

1) 凝胶孔径的不连续性: 浓缩胶为大孔胶;分离胶为小孔胶。在电场作用下,样品颗粒在 大孔胶中泳动的阻力小,移动速度快;当进入小孔胶时,受到的阻 力大,移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处,样品迁移受阻而压 缩成很窄的区带。

2) 电位梯度的不连续性: 电泳开始后,快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低 的低电导区,使局部电位梯度增高,将蛋白质浓缩成狭窄的区带

缓冲体系离子成分及pH值的不连续性

Tris:缓冲配对离子,维持溶液的电中性及pH值 Cl-: 在电场中迁移率快,前导离子(leading ion),快离子。 Gly:其pI =6.0,在pH6.8的浓缩胶缓冲体系中,甘氨酸解离度很小,因而在 电场中迁移很慢,称为尾随离子(trailing ion),慢离子。当进入 pH8.8的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质;因此 Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。高电势梯度不存在了,各种蛋 白质仅会由于其分子量或构型的不同,在一个均一的电势梯度和pH条件 下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同,表现的泳动率的不同 被分开 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷,在电场中,都向正极移动。


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分子筛效应

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 ,这就是分子筛效应。

电荷效应

蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区,但由于每种蛋白质分子所带有效电荷不同,因而泳动率也不同,因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个区带。在进入分离胶时,电荷效应仍起作用。 目前,PAGE连续体系应用也很广,虽然电泳过程中无浓缩效应,但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离,加之在温和的pH条件下,不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活,也显示了它的优越性。

PAGE电泳据电泳装置不同分为圆盘及垂直的板状两种

前者凝胶是在玻璃管中聚合,样品分离区带染色后呈圆盘状,因而称为圆盘电泳; 后者凝胶是在两块间隔几毫米的平行玻璃板中聚合,故称为垂直板状电泳。两者电泳原理完全相同。


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蛋白质进行PAGE时,常用垂直板电泳。

垂直板电泳的优越性有:

表面积大而薄,便于通冷却水以降低热效应,条带更清晰。

在同一块胶板上可同时进行10个以上样品的电泳,便于在同一条件下比较分析鉴定,还可用于印迹转移电泳及放射自显影。

胶板制作方便,易剥离,样品用量少,分辨率高,不仅可用于分析,还可用于制备。

胶板薄而透明,电泳染色后可制成干板,便于长期保存与扫描。

可进行双向电泳。


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